Determinação da dimensão de fragmentos de DNA com base na respectiva mobilidade electroforética
Após a hidrólise do DNA com endonucleases de restrição realiza-se um electroforese em gel de agarose de modo a determinar a dimensão dos fragmentos resultantes.
Uma vez feita a electroforese, esta determinação pode ser realizada através de um método gráfico.
Preparação do gel de agarose
Dilui-se as gramas de agarose em água destilada conforme a concentração que se quer, juntamente com o tampão de electroforese TAE 1x: Tris-acetato 0,04 M; EDTA 0,001 M e o corante red safe. Aquece-se a 200ºC até diluir toda a agarose e deixa-se arrefecer num agitador magnético até cerca de 50ºC. Seguidamente deita-se o gel no berço e coloca-se o pente responsável pela formação dos poços. O gel tem de ser colocado com muito cuidado para não formar bolhas pois estas dificultam a migração do DNA e numa superfície horizontal para os poços não ficarem tortos. Deixa-se polimerizar e retira-se o pente.
Electroforese em gel de agarose
Num tubo coloca-se o DNA intacto + tampão de amostra (glicerol 30% (v/v); azul de bromofenol 0,25% (m/v); xileno cianol 0,25% (m/v)) e noutro tubo coloca-se o DNA digerido com as endonucleases de restrição + tampão de amostra. No tampão de amostra o azul de bromofenol é responsável pela coloração do DNA e o glicerol por fazer com o DNA reste no fundo do poço por ser mais denso que a água.
Os marcadores de massa molecular utilizados serão: lambda HindIII e 1Kb+. O primeiro marcador tem esta designação pois é proveniente de um fago em que se conhece o tamanho dos fragmentos se digerido com a enzima de restrição HindIII.
Estes marcadores são para moléculas de DNA lineares, não poderiam ser utilizados para determinar o tamanho das moléculas de DNA intacto.
Fig.1 - Marcadores de massa molecular
Coloca-se as soluções nos poços e deixa-se a electroforese prosseguir durante 1h a 90V. Finda a electroforese analisa-se e fotografa-se o gel.
Determinação da dimensão dos fragmentos
Utilizando um papel semi-logarítmico, coloca-se no eixo dos yy os logaritmos decimais das dimensões de cada fragmento de restrição do DNA do fago lambda (dimensão conhecida) em kb e no eixo dos xx a mobilidade dos respectivos fragmentos, ou seja, a distância percorrida por cada fragmento a partir do poço do gel (em mm). Estas distâncias são medidas com régua na fotografia do gel de agarose. A curvatura será menos marcada se a corrida electroforética for feita a uma baixa voltagem.
O resultado será um linha descendente pois quanto maior a distância percorrida menor será o tamanho dos fragmentos.
No poço do DNA intacto podem aparecer diversas bandas porque são as diferentes conformações que o DNA pode apresentar: circular, linear ou superenrolada.
