Hidrólise de DNA por Endonucleases de Restrição
Após o cálculo da concentração de DNA isolado, realiza-se uma digestão das moléculas de DNA circular através de uma enzima que hidrolisa num único sítio, de modo a dar origem a um fragmento linearizado. Se a enzima cortou-se em dois sítios dava origem a dois fragmentos, e assim sucessivamente.
Se uma molécula de DNA circular não for digerida, na electroforese em gel de agarose dará origem à forma superenrolada (supercoiled) que é capaz de migrar mais rapidamente pois oferece menos resistência.
Fig. 1 - Exemplo das bandas resultantes das várias conformações do DNA plasmídico
É apenas possível comparar tamanhos de bandas se as moléculas estiverem todas na mesma conformação, pois, uma molécula com forma superenrolada pode estar no mesmo sítio que um fragmento linear pequeno mas no entanto apresenta mais pares de bases, apenas andou o mesmo devido à sua facilidade de migração.
Uma reacção de restrição contém o seguinte:
- DNA do plasmídeo a ser digerido;
- tampão adequado à enzima - composto por um agente tamponizante (normalmente Tris-HCl), um sal (NaCl ou KCl) para um equilíbrio inónico adequado e magnésio que actua como co-factor, doando iões, para a actividade da enzima.
- água esterilizada para perfazer o volume.
Fig. 2 - Modo de acção da EcoRI
Após incubação a 37ºC para que ocorra a hidrólise inactiva-se a enzima por aquecimento a 65ºC durante cerca de 10min.
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