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Hibridação molecular

Desnaturação

A desnaturação de um DNA consiste na sua separação em cadeia simples (SB – simple brin). Esta desnaturação pode ocorrer através de: calor, pH (muito ácido – HCl - ou muito básico – NaOH) ou um agente desnaturante.

Pode-se voltar a ter um DNA em cadeia dupla (DB – double brin) – resnaturação – colocando as duas cadeias simples juntas a uma temperatura mais baixa, mas:

- se arrefecermos muito rápido temos apenas resnaturação parcial;

- se arrefecermos progressivamente temos uma resnaturação completa.

Se deixarmos o DNA SB em gelo, este manter-se-á em cadeia simples.

Fig. 1 – Gráfico de desnaturação do DNA

Pode-se definir um valor de DO que corresponda a um valor de temperatura (50% DB, 50% SB) que se designa de T_m (melting temperature), ou seja, temperatura de fusão.

Existem no entanto parâmetros que influenciam a Tm:

- A composição em bases, ou seja, a percentagem de citosina e guanina, pois quanto mais esta percentagem for elevada, mais elevada será a Tm;

- O comprimento dos fragmentos, pois quanto maiores forem os fragmentos, maior será a Tm.

Fig.2 – Gráfico de %GC vs T_m

Tm = 2(A + T) + 4(G + C)     -> Para pequenos fragmentos

Tm = 69,3 + 0,41 (%G + C)        -> Para grandes fragmentos (a partir de 200pb)

Influência da temperatura na hibridação:

-       T° > T_m – desnaturação

-       T° = T_m – Bom

-       T° < T_m – pode existir erros

Fig.3 – Influência da temperatura na hibridação

Southern Blot

Técnica de hibridação para a detecção de fragmentos de DNA onde é utilizado DNA como matriz.

Etapas:

1º) Desnaturação do DNA com pH (HCl) e em seguida com NaOH;

2º) Digestão do DNA com enzimas de restrição;

3º) Electroforese em gel de agarose – após este procedimento, não iremos observar bandas mas sim uma mancha vertical chamada smear;

4º) Sobre o gel iremos colocar: uma membrana de nylon, um filtro Watmann, papéis absorventes e um peso (sob esta ordem);

5º) O líquido vai subir e o DNA ficará retido na membrana de nylon;

6º) Coloca-se a membrana dentro de um saco plástico com as sondas marcadas radioactivamente;

7º) Lavagem das sondas com solução tampão para retirar as sondas soltas e parcialmente ligadas;

8º) Autoradiografia – junta-se a membrana de nylon a um papel autoradio e este vai absorver as bandas e iremos então observá-las.

Fig. 4 – Ilustração de um Southern Blot

Resultado:

Fig.5 – Resultado de um Southern Blot

No número 1, podemos observar um marcador com os tamanhos das bandas conhecidos para podermos saber o tamanho das bandas obtidas.

Northern Blot

Esta técnica apresenta um procedimento idêntico à técnica anterior mas a matriz utilizada é o RNA.

Não são necessárias enzimas de restrição bem como desnaturação pois o RNA já apresenta um tamanho inferior e cadeia simples, mas no entanto a electroforese é feita num gel desnaturante (pois durante a realização do gel acrescenta-se formaldeído).

Fig.6 – Resultado de um Northern Blot

Western Blot

Tal como o Northern Blot, o procedimento desta técnica é igual à excepção de que aqui são utilizadas proteínas em vez de DNA ou RNA.

Como sondas para hibridação são utilizados anticorpos.