EXERCÍCIOS
1. Seja a sequência de nucleótidos seguinte correspondente à extremidade 5' da sequência que codifica um gene de rato (o primeiro tripleto, ATG corresponde ao codão de iniciação da tradução; apenas uma cadeia está representada):
ATGGATTCTGAGGTTGCTGCTTTGGTTATTGATAACGGTTCTGGTATGTGTAAAGCCGGT
TTTGCCGGTGACGACGCTCCTCGTGCTGTCTTCCCATCTATCGTCGGTAGACCAAGACAC
CAAGGTATCATGGTCGGTATGGGTCAAAAAGACTCCTACGTTGGTGATGAAGCTCAATCC
AAGAGAGGTATCTTGACTTTACGTTACCCAATTGAACACGGTATTGTCACCAACTGGGAC
GATATGGAAAAGATCTGGCATCATACCTTCTACAACGAATTGAGAGTTGCCCCAGAAGAA
CACCCTGTTCTTTTGACTGAAGCTCCAATGAACCCTAAATCAAACAGAGAAAAGATGACT
a) Propõe um par de primers que permitam amplificar a integralidade desta sequência por PCR. Escreve os primers no sentido convencional 5' - 3'.
b) Qual será o tamanho do produto PCR obtido?
c) Desejamos utilizar o produto obtido por PCR como sonda numa experiência de Southern. Propõe uma maneira de tornar esse fragmento radioactivo.
d) A experiência foi realizada depois de se ter preparado o DNA do rato. Este DNA foi submetido a uma digestão pela enzima BamHI numa extremidade e noutra pela enzima EcoRI. As duas misturas reaccionais foram depositadas num gel de agarose e hibridadas com uma sonda radioactiva depois de se ter aplicado a técnica Southern Blot. Na pista "BamHI" obteve-se um sinal de tamanho estimado de 2,5kpb e na pista "EcoRI" obtiveram-se dois fragmentos: um de tamanho 0,7 kpb e outro de 3,5. Refere-se que a sequência aqui representada não apresenta nem sítio de restrição BamHI nem EcoRI. Como se pode explicar este resultado (apoio de esquemas)?
e) Desejas ligar dois fragmentos de DNA. Um obtido por BamHI (G/GATCC) e outro por PstI (CAGCT/G). Como poderias proceder?
f) Desenha o resultado de uma electroforese obtida após sequenciação de uma molécula de DNA da qual foi deduzida a sequência 5’-TGAACCATTTCGAGCT-3’ (cada pista do gel deve corresponder a uma reacção efectuada com um dos 4 ddNTPs possíveis; o polo basal do gel corresponde ao polo positivo). Indica igualmente o sentido de migração e de leitura no teu esquema).
g) Estabelece a carta de restrição do plasmídeo de onde a análise de restrição deu o resultado seguinte (os tamanhos dos fragmentos obtidos encontram-se em kpb)
Por EcoRI : 1,8 ; 8,2
Por BamHI : 1 ; 4 ; 5
Por SalI : 10
Por PstI : 1 ; 9
Por EcoRI+BamHI : 0,9 ; 1 ; 1,8 ;
2,3 ; 4
Por EcoRI+SalI : 1,8 ; 2,4 ; 5,8
Por EcoRI+PstI : 1 ; 1,8 ;
2,2 ; 5
Por BamHI+SalI : 0,5 ; 1 ; 3,5 ;
5
Por SalI+PstI : 0,2 ; 0,8 ; 9.
h) Que dará uma dupla digestão com BamHI + PstI?
i) Explica como se determina o tamanho do fragmento de restrição por electroforese em gel de agarose.
2. Deseja-se proceder à ligação de um fragmento de DNA obtido por digestão com as enzimas SmaI e PvuII com o vector pBluescript II SK (+/-) digerido por BamHI e tratado com o fragmento de Klenow.
BamHI : G/GATCC ; SmaI : CCC/GGG ; PvuII : CAG/CTG
a) Porque é que é necessário realizar o tratamento com o fragmento de Klenow?
b) Que outro tratamento (antes da ligação) convinha realizar para melhorar a eficácia da inserção?
c) Indica uma sequência (cadeia dupla) das duas extremidades do insert uma vez o vector recombinante obtido. Indica claramente a orientação das cadeias.
d) Depois da ligação e transformação, como seleccionarias as bactérias transformadas pelo plasmídeo (recombinante ou não)?
e) Como se pode facilmente recuperar as bactérias hospedeiras do plasmídeo pBluescript recombinante antes de se realizar uma minipreparação?
3. A partir da sequência dada (apenas uma cadeia orientada no sentido 5' - 3'), propõe um par de primers de 20 nucleótidos que permita de a amplificar na realidade. Indica os primers no sentido convencional 5' - 3'.
4. Seja a carta de restrição de uma região genómica de um organismo qualquer:
a) Como se pode supor que se trata de um organismo eucariota?
b) Uma sonda radioactiva é preparada a partir do fragmento de EcoRI de 0,7 kpb e procede-se a uma experiência de hibridação por Southern com o fragmento de DNA genómico digerido pela enzima BamHI. Que resultados se pretende obter?
c) Utiliza-se a mesma sonda para fazer uma experiência do tipo Northern. Que se espera obter?
d) Para esta mesma técnica, observa-se que os RNA de certas células deste organismo detectam uma banda de 2,7 kb e nenhuma outra. Qual poderá ser a explicação?
5. Deseja-se estudar, no rato, o homólogo do gene M caracterizado na galinha. Para isso, experimentou-se clonar o sítio EcoRI do vector plasmídico pBR330 um fragmento EcoRI-EcoRI do DNA genómico de rato que contém o gene homólogo a M.
a) Apresenta com precisão, todas as etapas de clonagem molecular deste fragmento EcoRI e indica as técnicas moleculares utilizadas e as suas funções.
b) Que tipos de bactérias pode-se obter depois da transformação?
c) Como se pode efectuar a selecção de clones que contêm os plasmídeos recombinantes?
d) Quantos tipos de plasmideos recombinantes se pode obter?
6. Um plasmideo recombinante denominado pBM1 é digerido pelas enzimas de restrição BamHI e EcoRI. Depois de uma electroforese em gel de agarose em presença de BET, obtém-se os perfis seguintes:
a) Qual é o tamanho do insert?
b) Quantos sítios de restrição BamHI comporta o plasmideo recombinante?
c) Indica a carta de restrição do plasmideo recombinante pBM1 fazendo aparecer a posição de todos os sítios BamHI e EcoRI.
7. A enzima de restrição XbaI reconhece a sequência (cortando como indicado nas setas):
a) Escreve a sequência de cadeia dupla de uma das extremidades de um fragmento de DNA obtido depois de uma hidrólise com esta enzima e tratado com o fragmento de Klenow. Justifica.
b) A mesma questão se o fragmento for cortado com a enzima PstI:
b) Que outro tratamento (antes da ligação) convinha realizar para melhorar a eficácia da inserção?
c) Indica uma sequência (cadeia dupla) das duas extremidades do insert uma vez o vector recombinante obtido. Indica claramente a orientação das cadeias.
d) Depois da ligação e transformação, como seleccionarias as bactérias transformadas pelo plasmídeo (recombinante ou não)?
e) Como se pode facilmente recuperar as bactérias hospedeiras do plasmídeo pBluescript recombinante antes de se realizar uma minipreparação?
3. A partir da sequência dada (apenas uma cadeia orientada no sentido 5' - 3'), propõe um par de primers de 20 nucleótidos que permita de a amplificar na realidade. Indica os primers no sentido convencional 5' - 3'.
1 GATCTGTGCT GGGCGACGAG AGCATCGCAG AAATCGACAT CTGGCGGTCG GCAGGAGGCA
61 CAGCAGCGGT GAGTACGCGA CTATGGCCGT TGGACGCGGA CGGAGGTCCT GTCTCGGTGT
121 GCTCATCGTT GGTGTTCATG ACAATCGGCG ATGGCGAACT AACAAATAAG TTTTAAAAAG
181 CTCCACGGGA ATTATTTGCC ACCTGACGCT TAGTTTGTGT GTTGGTGTTG CTCGATTTAA
241 ATTTTTCTCT CGTGCTGGTT GATTCGTTAT TCGTTTTCAT TGAACGGAAA AAGGGCCGTA
301 GAACGGGATT TAATTATAGC GATCTGGAGG GCACAGTAGG ACAGTTTGAG GGGTCTTTTG
361 CTGTATAAAG AGCGTTGCAG CACTTGGAAG TAGCCGTGAA CACCCGACGC TCGGTTTTCT
421 AGTACAGCTC ACTGCCCACC CCTGTTGTCC GACCCGTCGA TCGGCTTTTA GTATTTTTAT
481 TCCTGCGAGC GCAAATCAGG AATTTTTGCC GACCCCCACT TTGTTGTCTC TTTTTCTTCC
541 TCACCATGTC TCAACAGCCA GCAACGACCA GCCGTGCAGA GCTGGTATCC AGCGCAGTTG
4. Seja a carta de restrição de uma região genómica de um organismo qualquer:
a) Como se pode supor que se trata de um organismo eucariota?
b) Uma sonda radioactiva é preparada a partir do fragmento de EcoRI de 0,7 kpb e procede-se a uma experiência de hibridação por Southern com o fragmento de DNA genómico digerido pela enzima BamHI. Que resultados se pretende obter?
c) Utiliza-se a mesma sonda para fazer uma experiência do tipo Northern. Que se espera obter?
d) Para esta mesma técnica, observa-se que os RNA de certas células deste organismo detectam uma banda de 2,7 kb e nenhuma outra. Qual poderá ser a explicação?
5. Deseja-se estudar, no rato, o homólogo do gene M caracterizado na galinha. Para isso, experimentou-se clonar o sítio EcoRI do vector plasmídico pBR330 um fragmento EcoRI-EcoRI do DNA genómico de rato que contém o gene homólogo a M.
a) Apresenta com precisão, todas as etapas de clonagem molecular deste fragmento EcoRI e indica as técnicas moleculares utilizadas e as suas funções.
b) Que tipos de bactérias pode-se obter depois da transformação?
c) Como se pode efectuar a selecção de clones que contêm os plasmídeos recombinantes?
d) Quantos tipos de plasmideos recombinantes se pode obter?
6. Um plasmideo recombinante denominado pBM1 é digerido pelas enzimas de restrição BamHI e EcoRI. Depois de uma electroforese em gel de agarose em presença de BET, obtém-se os perfis seguintes:
a) Qual é o tamanho do insert?
b) Quantos sítios de restrição BamHI comporta o plasmideo recombinante?
c) Indica a carta de restrição do plasmideo recombinante pBM1 fazendo aparecer a posição de todos os sítios BamHI e EcoRI.
7. A enzima de restrição XbaI reconhece a sequência (cortando como indicado nas setas):
b) A mesma questão se o fragmento for cortado com a enzima PstI:
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