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Cálculo da Concentração de DNA

Após extracção alcanila de DNA plasmídico procede-se à medição da concentração de DNA presente na amostra extraída através do método de espectrofotometria.

Lei de Lambert-Beer

Esta lei baseia-se na intensidade retida por um substância quando esta é atravessada por um feixe de luz. Lambert demonstrou que a intensidade da radiação absorvida dependia:

- do poder de absorção da substância;

- do comprimento de onda da radiação incidente.

Demonstrou também que a intensidade de radiação absorvida era proporcional à espessura da camada atravessada.

Beer demonstrou que para uma certa espessura, o coeficiente de absorção de uma substância era directamente proporcional à concentração da substância.

A junção destas duas constatações formulou a Lei de Lambert-Beer e serve como base aos métodos espectrofotométricos.

I1 < I0

log I0/I1 = E . l . c

Ao (log I0/I1) denomina-se Absorvância (A).

Logo, A = E. l . c   ,  sendo c a concentração e o E do DNA é igual a 20.

As proteínas absorvem maioritariamente um c.d.o. na ordem dos 280 nm (UV) e os ácido nucleicos por volta dos 260 nm (UV). A razão entre as leituras a 260 e 280 nm permite-nos saber a pureza do DNA extraído. Uma razão de 1,8 significa 100% de qualidade. Uma razão inferior a este valor indica-nos uma contaminação de proteínas. Se a razão for superior a 2,0 significa que há contaminação de RNA.

Sabe-se que para o DNA de dupla hélice, quando a absorvância medida a 260 nm é igual a 1 que a concentração de DNA é 0,05 mg/ml e para o RNA é de 0,04 mg/ml.