Bio Port(ug)al

Construção de bancos de DNA

1) Bancos de DNA genómico

Um banco de DNA genómico é um conjunto de vários fragmentos de DNA, todos diferentes mas que representam o mesmo genoma.

Neste caso, todo o genoma é clonado, não há eliminação de intrões.

Procedimento:

1º) Extracção de DNA genómico

2º) Corte do DNA com ultra-sons (aleatório) ou com ER (específico)

3º) Clonagem dos fragmentos com vectores de clonagem (não com plasmídeos)

4º) Amplificação

2) Bancos de DNAc

Um banco de DNA complementar é um conjunto de transcritos de RNAm, ou seja, não existem intrões, apenas genes. Neste caso utiliza-se para a sua clonagem vectores de expressão.

Procedimento:

1º) Extracção do RNAm

2º) Hibridação com um primer oligodT

3º) Polimerase de DNA complementar por transcriptase inversa

4º) Eliminação do RNA com uma RNAse

5º) Adição de uma cauda poli-G

6º) Hibridação com um primer oligo dC

7º) Síntese da cadeia complementar com a DNA polimerase

8º) Protecção do DNAc com metilação

9º) Adição de terminações EcoRI

10º) Corte do vector com EcoRI

11º) Ligação entre o fragmento e o vector através de uma ligase

12º) Cultura in vitro

13º) Selecção de clones de DNAc