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Extracção alcalina de plasmídeos

Os plasmídeos são moléculas de DNA circular extracromossómico que existem nas bactérias (Ver: Vectores de Clonagem). A sua principal vantagem em investigação é que são dispensáveis, por isso podem ser extraídos das bactérias sem que lhes cause qualquer diferença. Têm a capacidade de se replicarem autonomamente e podem apresentar genes de resistência a antibióticos ou outros stresses.

Existem dois grandes grupos de plasmídeos: os que se integram e os que não se integram no DNA cromossómico.

Fig. 1 - Representação do DNA plasmídico e do DNA cromossómico numa bactéria

Em investigação os plasmídeos são muito importantes como vectores na tecnologia do DNA recombinante. Uma característica muito importante em trabalhos laboratoriais com plasmídeos é que podem existir até centenas de plasmídeos na mesma bactéria.

Estas técnicas iniciam-se pela extracção de DNA plasmídico (isolamento e purificação) a partir de uma cultura de bactérias previamente transformada com um determinado plasmídeo. Para isso tem de se provocar a lise das células, ou seja, todo o DNA é recolhido, não apenas o plasmídico por isso, seguidamente, tem de se fazer uma purificação para os separar. O DNA genómico existe em maior quantidade na célula que o plasmídico.

Esta separação baseia-se nas diferenças físicas entre o DNA plasmídico e o DNA genómico como por exemplo, no tamanho e na conformação. O DNA cromossómico de elevada massa molecular desnatura-se em elevados valores de pH - lise alcalina - enquanto o DNA plasmídico se mantém em cadeia dupla.

Após a purificação do DNA plasmídico, a sua análise é feita através de electroforese em gel de agarose em presença de um marcador molecular. As moléculas de DNA têm carga negativa devido à presença de grupos fosfato na sua constituição por isso vão migrar em direcção ao polo positivo. Esta migração ocorre pois o gel de agarose é constituído por uma complexa rede de poros que permite a passagem das moléculas de DNA. Os plasmídeos mais pequenos vão migrar mais depressa, ou seja, vão ficar mais próximos do polo positivo.

Fig. 2 - Ilustração de um electroforese em gel de agarose

Finda a electroforese o gel é visualizado num transiluminador sob luz ultravioleta. Tal é possível devido à presença de um corante fluorescente.

Exemplo de um procedimento experimental:

Uma cultura de E.coli foi colocada a inocular durante a noite em meio LB (Luria Broth) com "glicerol stock" suplementado com 100 mg/ml de ampicilina, a 37ºC num agitador com cerca de 200 ciclos/ min. Somente as bactérias com um plasmídeo com o gene de resistência à ampicilina crescem neste meio.

Adicionou-se 2 mL desta cultura bacteriana a um microtubo de 2 mL e centrifugou-se, rejeitando o sobrenadante para que se restasse apenas com o sedimento celular.

Resuspendeu-se as células em solução A (Tris-­HCl pH 8 : 50 mM; EDTA.2H2O 10 mM) - tampão de resuspensão. Esta solução é responsável, principalmente por impedir variações de pH na solução. O EDTA é um quelante, ou seja, forma complexos com os iões metálicos. Tem a função de inibir as DNAses e de romper a membrana externa das batérias gram-negativas ao remover o magnésio da camada de lipopolisacáridos. Este magnésio é muito importante pois actua como doador de iões para determinadas enzimas que dependem de magnésio (Ex: nucleases).

Seguidamente adicionou-se a solução B (NaOH 0,2 M; dodecil sulfato de sódio (SDS) 1% (m/v)) - solução de lise alcalina. O hidróxido de sódio (NaOH) é uma base forte que vai alcalinizar o meio provocando a desnaturação do DNA cromossómico. O SDS é um detergente iónico que destabiliza as membranas, desnaturando os lípidos e as proteínas provocando assim a lise da maioria das células e a inactivação das DNAses.

Adicionou-se posteriormente a solução C (KOAc pH 4,8 1,32 M) - solução de neutralização. O acetato de potássio é um sal que em solução dissocia-se dando origem ao ácido acético. Vai restabelecer o pH da solução.

Após uma centrifugação de cerca de 10 minutos, transferiu-se o sobrenadante (DNA) para um tubo. O pellet é desprezado pois contém apenas proteínas. Neste tubo colocou-se a solução D (NaI 6 M) - solução caotrópica. O iodeto de sódio aumenta a entropia da solução facilitando assim a ligação do DNA à sílica que se encontra no funil.

Adicionou-se a sílica e deixou-se repousar por 5 minutos para que o DNA se ligasse. Centrifugou-se e retirou-se o sobrenadante.

Lavou-se a sílica com a solução E (etanol 50% (v/v); Tris-­‐HCl pH 8 10 mM; NaCl 100 mM, EDTA.2H2O 1 mM) - solução de lavagem. Esta solução serve para quebrar as ligações entre o DNA e a sílica. Os ácido nucleicos são insolúveis em etanol logo vão precipitar.

Centrifugou-se e removeu-se o sobrenadante com muito cuidado.

Resuspendeu-se com água esterilizada vortexando e colocou-se a 70ºC durante 2 min.