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Vectores de Clonagem

Os vectores de clonagem, tal como o nome indica, são materiais biológicos utilizados na clonagem de DNA.

Existem diversos vectores de clonagem:

- Plasmídeos – provém de bactérias

- Fago - provém de bactérias

- Cosmídeos - provém de bactérias

- BAC - provém de bactérias

- YAC - provém de leveduras

1) Plasmídeos

Os plasmídeos são moléculas circulares de DNA em cadeia dupla, provenientes de bactérias, e que se reproduzem independentemente do DNA cromossómico.

Possuem 3 sítios essenciais:

- Uma origem de replicação (designada ori nas bactérias) – essencial para a sua replicação e transmissão para a descendência;

- Uma marca genética de selecção – características únicas que os permitam identificar facilmente e seleccionar, ou seja, como é usado maioritariamente, genes de resistência a antibióticos;

- Um sítio de clonagem múltipla (MCS) – um sítio que contenha as sequências reconhecidas pelas enzimas de restrição. Normalmente um sítio para cada enzima, para que esta possa “abrir” o plasmídeo e ser aí colocado o insert. Este sítio não é no entanto obrigatório.

Fig.1 – Plasmídeo com e sem insert

Vantagens dos plasmídeos como vectores de clonagem:

-  podem ser introduzidos facilmente em bactérias: transformação

- podem ser facilmente purificados e selecionados

- existem em grande número de cópias em cada bactéria

Exemplo de um plasmídeo e o correspondente sítio de múltipla clonagem:

Fig.2 – Plasmídeo pBluescript SK- e respectivo MCS

Método de clonagem:

Fig. 3 - Etapas de clonagem com plasmídeos

2)  Fagos

Os fagos são vírus que infectam bactérias e por isso designados por bacteriófagos e têm uma estrutura especialmente peculiar. Possuem uma cabeça, na qual está inserida o DNA, e uma cauda que fecha essa cabeça. São por isso utilizados em clonagem de DNA.

Fig.4 – Estrutura de um bacteriófago

Após injectarem a bactéria podem seguir dois ciclos:

-       Ciclo lítico – após inserção do DNA na bactéria há produção de proteínas virais e multiplicação do DNA viral. Estas proteínas vão formar novos bacteriófagos e estes vão provocar a lise da célula para se libertarem.

-        Ciclo lisogénico – O DNA viral após entrar na bactéria insere-se no DNA bacterial e a bactéria vai-se reproduzir e passar este DNA viral para a descendência.

Fig.3 – Ciclos de um bacteriófago 

3)  Cosmídeos

Os cosmídeos são o resultado de uma hibridação entre plasmídeos e fagos (fago λ). Dos plasmídeos têm a sua origem de replicação e uma marca genética de selecção e do fago λ obtiveram as suas extremidades COS.

São usados para a clonagem de fragmentos de DNA superiores a 45kb.

Fig.6 – Exemplo de um cosmídeo

4) BACs e YACs (Yeast artificial chromossome)

O vector de clonagem YAC, tal como o nome indica é conhecido por ser um cromossoma artificial pois possui sequências centroméricas e teloméricas.

É usado para replicar enormes fragmentos de DNA (100 a 2000kb) mas, à diferença de todos os outros vectores, o hospedeiro usado para clonagem é uma levedura, mais usualmente a Sacharomyces cerevisae.

O BAC procede da mesma maneira de o vector YAC, mas difere no hospedeiro de clonagem, que é uma bactéria.

Fig.7 – Exemplo de um vector YAC